Tecniche di coltura sferoidale
Questo articolo descrive brevemente le moderne tecniche di coltura degli sferoidi disponibili.
Colture di pellet
Nei sistemi di coltura in pellet, le cellule vengono forzate sul fondo della provetta tramite centrifugazione. Le adesioni cellula-cellula sono quindi facilitate dalla vicinanza delle singole cellule sul fondo. I surnatanti vengono quindi rimossi e il pellet cellulare risospeso in un terreno di coltura appropriato per la formazione di sferoidi. Una volta noto il conteggio delle cellule, la sospensione cellulare viene quindi aggiunta ai singoli pozzetti di una piastra inferiore a U da 96 pozzetti con una superficie repellente per le cellule come le piastre a 96 pozzetti BIOFLOATTM. Questo metodo forma sferoidi in una piattaforma rapida e riproducibile, rendendolo una scelta eccellente per gli screening dei farmaci ad alta produttività (1-2).
Coltura in sospensione statica
In questa tecnica, gli sferoidi vengono formati interrompendo l'adesione cellula-cellula su piastre a fondo piatto non aderenti. Questi strati di coltura sono costituiti da agar o gel di agarosio. Il gel di agarosio è l'opzione preferita del metodo di sovrapposizione liquida, poiché previene efficacemente l'adesione cellulare rispetto all'agar. L'interruzione dell'adesione cellulare in questo modo promuove quindi l'aggregazione cellulare spontanea sopra la superficie non aderente. È possibile utilizzare biomateriali alternativi non aderenti, come l'acido ialuronico, che incidentalmente è più adatto per l'uso nelle colture di sferoidi tumorali (3).
Metodo di caduta sospesa
La tecnica della coltura a goccia sospesa prevede l'aggregazione di singole cellule e lo sferoide sotto forma di goccioline. La forma unica della goccia si ottiene regolando il volume della goccia o la densità della sospensione cellulare. Questo metodo consente di formare in modo efficiente sferoidi di dimensioni fisse. La meccanica generale del metodo delle gocce sospese comprende una coltura cellulare monostrato, preparata come sospensione e diluita con un terreno di coltura appropriato per ottenere la densità cellulare desiderata. Quindi la sospensione cellulare viene aggiunta nei pozzetti di una mini-piastra con l'aiuto di una pipetta multicanale compatibile. Viene quindi posizionato un coperchio sul mini-vassoio e l'intero mini-vassoio viene capovolto. Le gocce di sospensione cellulare fissate sul mini-vassoio rimarrebbero quindi sul lato opposto grazie alla tensione superficiale. La formazione di sferoidi delle goccioline è facilitata dall'azione simultanea della tensione superficiale e della forza gravitazionale (1,4).
Cultura dello spinner
La sezione cultura sferoidale La tecnica prevede l'agitazione continua della sospensione cellulare nel contenitore del bioreattore con pallone rotante. Lo sferoide risultante è controllato dalla dimensione del contenitore del bioreattore. La forza convettiva dell'ancoretta determina il fluido e la massa nei contenitori e di conseguenza la formazione di sferoidi. Se la sospensione cellulare viene agitata troppo velocemente, le cellule potrebbero danneggiarsi, mentre se agitata troppo lentamente, le cellule potrebbero affondare sul fondo del contenitore impedendo la formazione di sferoidi (1).
Vaso a parete rotante
La tecnica del vaso a parete rotante ricrea la microgravità mediante rotazione circolare costante. Poiché le cellule vengono costantemente ruotate, rimangono in sospensione nel vaso, dando luogo alla formazione di sferoidi circolari (5-6).
Laboratorio su un chip
Lab on a chip è una tecnica di coltura microfluidica comunemente utilizzata per l'analisi di singole cellule e per gli screening della tossicità dei farmaci. La tecnica Lab on Chip consiste in dimensioni su microscala rappresentative dell'ambiente in vivo e che ricreano così la struttura 3D nativa. I dispositivi microfluidici includono anche materiali che consentono facilmente l'ossigeno e altri fattori di crescita essenziali per la proliferazione. Ciò aiuta a ridurre l'ipossia, che è uno svantaggio comune associato alle colture sferoidi. I moderni dispositivi fluidici offrono anche design diversi, a costi ridotti, e consentono il monitoraggio in tempo reale delle cellule in un microambiente facilmente modificabile, il che li rende la scelta migliore per test ad alta intensità (7,8).
Levitazione magnetica
Il sistema di levitazione magnetica prevede la miscelazione delle cellule con particelle magnetiche e la loro sottoposizione a una forza magnetica durante il processo di coltura. Utilizza la magnetoforesi negativa, che imita uno stato di assenza di gravità. La forza magnetica esercitata fa sì che le cellule combinate con le particelle magnetiche rimangano levitate o fluttuanti contro la gravità. Questa condizione provoca un cambiamento nella geometria della massa cellulare e stimola il contatto cellulare, portando all'aggregazione cellulare. Inoltre questo sistema può anche facilitare la co-coltura multicellulare con diversi tipi di cellule (9-11).
Riferimenti
1.Achilli,TM; Meyer, J.; Morgan, JR Progressi nella formazione, nell'uso e nella comprensione degli sferoidi multicellulari. Opinione degli esperti. Biol. Là. 2012, 12, 1347–1360.
2. Maritan, SM; Lian, EY; Mulligan, LM Un metodo di aggregazione cellulare efficiente e flessibile per la produzione di sferoidi 3D. J.Vis. Esp. 2017.
3. Costa, CE; de Melo-Diogo, D.; Moreira, AF; Carvalho, deputato; Correia, IJ Formazione di sferoidi su superfici non adesive mediante tecnica di sovrapposizione di liquidi: considerazioni e approcci pratici. Biotecnologie. J.2018, 13.
4. Timmins, NE; Nielsen, LK Generazione di sferoidi tumorali multicellulari mediante il metodo hanging-drop. Metodi Mol. Med. 2007, 140, 141–151.
5. Carpenedo, RL; Sargent, California; McDevitt, TC La coltura in sospensione rotante migliora l'efficienza, la resa e l'omogeneità della differenziazione del corpo embrionale. Cellule staminali 2007, 25, 2224–2234.
6. Manley, P.; Lelkes, PI Un nuovo sistema in tempo reale per monitorare l'aggregazione cellulare e le traiettorie nei bioreattori con vasi a parete rotante. J. Biotecnologie. 2006, 125, 416–424.
7. Ziolkowska, K.; Jedrych, E.; Kwapiszewski, R.; Lopacinska, J.; Skolimowski, M.; Chudy, M. Sistema di coltura cellulare microfluidica in vetro PDMS per test di citotossicità e passaggio cellulare. Attuatori sensibili B Chim. 2010, 145, 533–542.
8. No, FQ; Yamada, M.; Kobayashi, J.; Yamato, M.; Kikuchi, A.; Okano, T. Saggio di migrazione cellulare su chip utilizzando canali microfluidici. Biomateriali 2007, 28, 4017–4022.
9. Anil-Inevi, M.; Yaman, S.; Yildiz, AA; Mese, G.; Yalcin-Ozuysal, O.; Tekin, HC; Ozcivici, E. Biofabbricazione di colture cellulari 3D autoassemblate in situ in un ambiente privo di gravità generato utilizzando la levitazione magnetica. Sci. Rep. 2018, 8, 7239.
10. Kim, JA; Choi, JH; Kim, M.; Rhee, WJ; Figlio, B.; Jung, Hong Kong; Park, TH Generazione ad alto rendimento di sferoidi utilizzando nanoparticelle magnetiche per colture cellulari tridimensionali. Biomateriali 2013, 34, 8555–8563.
11. Lewis, NS; Lewis, EE; Mullin, M.; Wheadon, H.; Dalby, MJ; Berry, CC Sferoidi di cellule staminali mesenchimali levitate magneticamente coltivate con un gel di collagene mantengono il fenotipo e la quiescenza. J. Tessuto ing. 2017, 8, 204173141770442.
