Utilizzo della tecnologia sferoidale 3D nello screening farmacologico

I moderni processi di scoperta dei farmaci hanno incontrato battute d’arresto significative negli ultimi decenni, nonostante i progressi tecnologici compiuti negli strumenti analitici e nello sviluppo di modelli di ricerca. Ciò è dovuto principalmente all'uso di modelli biologici inadeguati che non imitano la fisiologia in vivo durante gli studi preclinici, nonché all'uso di colture monostrato 2D di linee cellulari immortalizzate che riflettono scarsamente la complessa architettura 3D delle cellule (1,2). . Tali limitazioni hanno portato allo sviluppo continuo di modelli cellulari per imitare meglio la fisiologia umana e le malattie che forniscono dati biologicamente rilevanti utili negli screening dei farmaci.

A tal fine, le moderne tecniche di coltura 3D includono sferoidi multicellulari, colture organotipiche, organoidi, organi su chip e tessuti biostampati in 3D (3). Sebbene queste tecniche abbiano migliorato la qualità delle colture in vitro, solo poche di queste tecniche sono adattabili ai processi di scoperta di farmaci. Lo screening ad alta produttività prevede il monitoraggio di migliaia di molecole chimiche e biologiche in test altamente standardizzati. Quanto più complessa diventa una tecnica di coltura 3D, tanto più difficile è la sua implementazione nel test ad alta produttività/contenuto con condizioni elevate di standardizzazione (3).

Colture e tecniche in vitro basate su sferoidi

La tecnologia sferoidale è ora diventata un compromesso in quanto le colture sferoidi possono essere facilmente standardizzate e adattate ai test esistenti fornendo allo stesso tempo alle colture cellulari un'organizzazione tissutale in vivo simile a quella 3D di sufficiente complessità (4). Alcuni modelli sferoidali o tumorali umani sono in grado di ricapitolare il microambiente tissutale completo di gradienti biologici, stratificazioni cellulari e differenziazione funzionale (5). Con i sempre maggiori progressi compiuti nella semplificazione della tecnologia degli sferoidi, è sulla buona strada per sostituire le colture 2D come opzione preferita per i processi di screening dei farmaci.

Gli sferoidi sono aggregati cellulari formati all'interno di una superficie strettamente definita. L'ampia gamma di tecniche di coltura di sferoidi comprende colture di sferoidi in sospensione in matracci rotanti, gocce sospese, metodi di levitazione magnetica, uso della microgravità all'interno di una matrice polimerica naturale o sintetica, metodi di sovrapposizione di liquidi in piastre rivestite di agar o agarosio. Le piastre per microtitolazione rivestite con agarosio si sono rivelate particolarmente efficaci negli screening di farmaci su larga scala, anche se il rivestimento interno può introdurre variabilità nell'imaging automatizzato degli sferoidi, influenzando così la riproducibilità (3).

Materiali di consumo per rispondere alla crescente domanda di test standardizzati sugli sferoidi

Molte aziende hanno sviluppato un'ampia gamma di materiali di consumo da laboratorio per contribuire a standardizzare i test multiplex sugli sferoidi. Questi includono piastre sospese, piastre ad attacco ultrabasso (ULA) e piastre e inserti micro/nanostrutturati. Tra tutte, le lastre ULA si sono rivelate le più efficaci in termini di usabilità e adattabilità alla maggior parte dei processi di vagliatura classici. Le piastre ULA formano sferoidi altamente uniformi compatibili con l'analisi ad alto rendimento utilizzando la microscopia a campo chiaro e a fluorescenza. Sono inoltre compatibili con il monitoraggio in tempo reale della risposta cellulare ai farmaci. Tuttavia i materiali di consumo ULA sono piuttosto costosi e il loro utilizzo può essere replicato con approcci più semplici come le piastre a bassa adesione (6).

Piastre a bassa adesione: rapide, rotonde e affidabili

Anche le piastre a basso attacco come le piastre BIOFLOAT™ da 96 pozzetti stanno diventando un'opzione preferita per gli screening farmacologici insieme alle piastre ULA. Sono a bassa tecnologia, facilmente modificabili per adattarsi agli standard di analisi, riproducibili e a basso costo. Queste piastre sono rivestite con uno speciale rivestimento polimerico che rende la superficie repellente alle cellule, favorendo così la formazione di aggregati cellulari. A tal fine, rivestito con FaCellitate BIOFLOAT™ U-bottom le piastre rispetto ad altre piastre ad attacco ultra basso (ULA) di riferimento hanno dimostrato una rapida generazione di sferoidi con struttura e consistenza ben definite. Ad esempio, gli epatociti primari coltivati ​​su piastre rivestite con FaCellitate BIOFLOAT™ hanno formato aggregati entro 24 ore dalla semina rispetto alle altre piastre ULA. Sferoidi compatti si formarono entro il giorno 3.

Inoltre gli sferoidi degli epatociti hanno dimostrato una robusta attività enzimatica basale simile a quella in vivo, indipendente dalla superficie della coltura, indicativa della sua compatibilità funzionale. L'eccellente natura repellente delle cellule delle piastre rivestite con BIOFLOAT™ promuove la formazione di sferoidi rotondi rapidi con morfologia e funzione coerenti. Le piastre rivestite sono resistenti ai graffi e consentono una facile manipolazione, dimostrandosi così un'eccellente piattaforma modificabile per valutare l'epatotossicità negli screening di risposta ai farmaci ad alta produttività (8).

Inoltre gli sferoidi possono anche essere coltivati ​​in piastre a pozzetti non trattati rivestite con un rivestimento speciale come la soluzione di rivestimento BIOFLOAT™ Flex. BIOFLOATTM Flex, è una soluzione di rivestimento polimerico che si lega rapidamente alle superfici in plastica e vetro, generando superfici con proprietà proteiche e repellenti alle cellule. Le elevate proprietà antiadesive della soluzione, fanno sì che le superfici cellulari diventino “invisibili” alla cellula, favorendo la crescita delle interazioni cellula-cellula che sono vitali per la normale struttura e funzione cellulare.

I materiali di consumo rivestiti BIOFLOAT™ Flex, rispetto alle piastre di riferimento, consentono la formazione di uno sferoide cellulare rotondo per pozzetto, che è un criterio importante per generare un'analisi cellulare riproducibile e affidabile e ad alta produttività, poiché tali analisi richiedono una distribuzione uniforme di uno ( simmetrico) sferoidale per pozzetto per la lettura specifica mediante sistemi automatizzati. BIOFLOATTM è flessibile ed è una soluzione ideale a basso costo per la coltura cellulare 3D. La natura robusta del legame lo rende applicabile a dispositivi microfluidici o celle a flusso. Nel complesso la soluzione BIOFLOATTM flex è uno strumento efficace e affidabile che può essere impiegato in test farmacologici ad alta produttività (7).

Riferimenti

1. Horvath P, Aulner N, Bickle M, Davies AM, Nery ED, Ebner D, et al. Escludere modelli di malattia basati su cellule irrilevanti. Nat Rev Drug Discov (2016) 15(11):751–69.

2. Scannell JW, Blanckley A, Boldon H, Warrington B. Diagnosi del declino dell'efficienza della ricerca e sviluppo farmaceutico. Nat Rev Drug Discov (2012) 11(3):191–200.

3. Mittler F, Obeïd P, Rulina AV, Haguet V, Gidrol X e Balakirev MY (2017) Monitoraggio ad alto contenuto degli effetti dei farmaci in un modello sferoidale 3D. Davanti. Oncol. 7:293.

4. Hirschhaeuser F, Menne H, Dittfeld C, West J, Mueller-Klieser W, Kunz-Schughart LA. Sferoidi tumorali multicellulari: uno strumento sottovalutato sta recuperando terreno. J Biotechnol (2010) 148(1):3–15.

5. Thoma CR, Zimmermann M, Agarkova I, Kelm JM, Krek W. Sistemi di coltura cellulare 3D che modellano i determinanti della crescita del tumore nella scoperta del bersaglio del cancro. Adv Drug Deliv Rev (2014) 6(9–70):29–41.

6. Comley J. Spheroids sta rapidamente diventando il formato di cultura 3D preferito. Drug Discov World (2017) 15:31–49.

7. https://facellitate.com/wp-content/uploads/White-Paper-BIOFLOAT-FLEX-1.pdf

8. https://facellitate.com/wp-content/uploads/Application-Note-Primary-Cells.pdf

9. Bu NU, Lee HS, Lee BN, Hwang YC, Kim SY, Chang SW, Choi KK, Kim DS, Jang JH. Caratterizzazione in vitro di cellule staminali di polpa dentale coltivate in due piastre di coltura che formano microsfere. Giornale di medicina clinica. 2020; 9(1):242.