Surveillance des changements d'expression génique comme mesure de la viabilité cellulaire dans la culture cellulaire 3D
Les cultures cellulaires tridimensionnelles deviennent rapidement la nouvelle norme pour la recherche sur les cultures cellulaires in vitro en raison de leur capacité efficace à imiter la biologie in vivo. Pour encourager ce passage de la culture 3D à la culture 2D, des méthodes quantitatives appropriées doivent être établies pour surveiller la qualité des cultures et mesurer les variables biologiques pertinentes (3).
Les profils d’expression génique constituent déjà une méthode quantitative bien établie pour évaluer le comportement cellulaire. Les profils sont capables de détecter les changements d’expression des gènes cellulaires lors d’une stimulation externe et en réponse à des signaux environnementaux (2,3). Les profils d’expression génique les plus courants destinés à mesurer la viabilité cellulaire comprennent la mesure de protéines et de séquences d’ARN spécifiques. Cependant, la plupart de ces méthodes impliquent la destruction de la culture, car les méthodes de micropuces, de RT-PCR ou de séquençage d'ARN nécessitent la lyse des cellules. De plus, des méthodes telles que la cytométrie en flux impliquent la désintégration de la culture. Les méthodes immunohistochimiques nécessitent la fixation de cultures, et d’autres technologies à haut débit ou à l’échelle du transcriptome exigent des conditions similaires. La principale raison derrière ces demandes est la nécessité d’accéder à l’ARN et aux protéines rares dans les cellules. Bien qu’il s’agisse effectivement de méthodes efficaces pour surveiller la viabilité cellulaire dans les cultures 2D, leur adoption dans la culture 3D reste encore une question (4).
Sondes fluorescentes
Plusieurs méthodes sont actuellement en développement qui pourraient potentiellement permettre une évaluation quantitative des changements d’expression des gènes en tant que marqueur de la viabilité cellulaire, au sein d’une culture 3D. Par exemple, des sondes fluorescentes peuvent pénétrer dans les cellules, se lier à des séquences d’ARN spécifiques ciblées et émettre des signaux forts, sans destruction de la culture. Bien que certaines limitations puissent survenir dans le maintien de la spécificité, de la précision et de l’efficacité de l’absorption, ces sondes restent une option viable à utiliser dans les cultures 3D à long terme (4,5).
Technologies d'édition génétique
De nouvelles stratégies alternatives incluent l'incorporation de technologies d'édition de gènes pour coupler un rapporteur fluorescent au niveau d'expression d'un gène d'intérêt. C’est une méthode avec une plus grande exactitude et précision. Cependant, la modification génétique ajoute une étape supplémentaire et peut entraîner des interactions indésirables ou des changements de comportement susceptibles d'affecter la qualité globale de la culture (6-8). Cependant, les sondes fluorescentes et les technologies d’édition de gènes sont bien adaptées pour surveiller les changements d’expression des gènes sur une période prolongée, tout en préservant la répartition des cellules au sein de la culture. De plus, ils permettent d'évaluer l'effet de différents microenvironnements sur le comportement de la culture (1).
Parmi les moyens potentiels d’augmenter le rendement de ces tests et de les rendre plus faciles à utiliser dans la culture 3D, il faut utiliser une combinaison de différentes lectures. Cette méthode a été utilisée pour la visualisation de structures cellulaires complexes au sein de tissus végétaux 3D (9) ; et avec des méthodes vitales appropriées de fluorescence-colorimétrie, il pourrait être adapté pour étudier l’expression des gènes dans les cellules 3D. Malgré leur efficacité et leur précision, presque toutes ces méthodes mentionnées ci-dessus nécessitent des progrès substantiels dans les analyses à l’échelle du transcriptome/protéome avant de constituer une option viable en tant que mesure de la viabilité cellulaire dans les cultures cellulaires 3D.
Bibliographie
1. Cortesi M, Giordano E. Surveillance non destructive des cultures cellulaires 3D : nouvelles technologies et applications. PeerJ. 2022 mai 12;10 :e13338. est ce que je: 10.7717/peerj.13338.
2. Picone G, Cappadone C, Pasini A, Lovecchio J, Cortesi M, Farruggia G, Lombardo M, Gianoncelli A, Mancini L, Ralf H M. 2020. Analyse du magnésium intracellulaire et des dépôts minéraux au cours
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3. Brady L, Gil da Costa RM, Coleman IM, Matson CK, Risk MC, Coleman RT, Nelson PS. 2020. Une comparaison des transcriptomes de cellules cancéreuses de la prostate en monoculture 2D par rapport aux xénogreffes 3D identifie des altérations cohérentes de l’expression génique associées aux microenvironnements tumoraux. La prostate 80(6):491-499
4. Waylen LN, Nim HT, Martelotto LG, Ramialison M. 2020. De l'évaluation spatiale globale à l'évaluation spatiale unicellulaire de l'expression des gènes en 3D. Biologie des communications 3(1):1–11
5. Okamoto A. 2019. Sondes d’acides nucléiques fluorescents de nouvelle génération pour l’analyse microscopique des acides nucléiques intracellulaires. Microscopie appliquée 49(1):1–7
6. He X, Chen H, Xu C, Fan J, Xu W, Li Y, Deng H, Shen J. 2020. Sonde fluorescente ratiométrique et colorimétrique pour moniteur d'hypochlorite et application pour la bioimagerie dans les cellules vivantes, les bactéries et le poisson zèbre. Journal des matières dangereuses 388:122029
7. Di Blasi R, Zouein A, Ellis T, Ceroni F. 2021. Boîtes à outils génétiques pour concevoir et construire des systèmes synthétiques de mammifères. Tendances en biotechnologie 39 : P1004–P1018.
8. Koch B, Nijmeijer B, Kueblbeck M, Cai Y, Walther N, Ellenberg J. 2018. Génération et validation de cellules knock-in fluorescentes homozygotes à l'aide de l'édition du génome CRISPR – Cas9. Protocoles naturels 13(6):1465
9. Ursache R, Andersen TG, Marhavy P, Geldner N. 2018. `Un protocole pour combiner des protéines fluorescentes avec des colorants histologiques pour divers composants de la paroi cellulaire. The Plant Journal 93(2):399-412 10. Wilkinson L, Friendly M. « L'histoire de la carte thermique des clusters.
