Testen der Zelllebensfähigkeit mithilfe multizellulärer Tumorsphäroide (MCTs)
Die Lebensfähigkeit der Zellen spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wirksamkeit und Zuverlässigkeit eines MCT-Modells. Es gibt viele etablierte Lebensfähigkeitstests wie kolorimetrische, Lumineszenz- und Fluoreszenztests. Diese Tests sind jedoch gut für herkömmliche 2D-Kulturen geeignet und optimiert. Es wurden einige Assays zum Testen der Zelllebensfähigkeit in 3D-Zellkulturen entwickelt, darunter die kolorimetrischen Cultrex® 3D- und CellTiter-Glo-Lumineszenzassays. Unabhängig von diesen kommerziellen Tests basieren die meisten Bewertungen der Zelllebensfähigkeit von MCTs jedoch immer noch auf denen, die für 2D-Kulturen optimiert sind (1,2).
Konventionelle Lebensfähigkeitstests
Zelllebensfähigkeitstests werden über ein Fluoreszenzsignal bestimmt, das von zerfallenen Zellen oder ganzen kompakten Sphäroiden abgegeben wird. Herkömmlicherweise werden MCTs aufgeschlossen und das Zelllysat oder die Zellsuspension analysiert. Diese Analysemethode berücksichtigt jedoch nicht mehrere Aspekte der Sphäroide, einschließlich etwaiger morphologischer Veränderungen. Um solche schlechten Ergebnisse zu vermeiden, wird die Bildgebung intakter MCTs bevorzugt, obwohl dies aufgrund der langen Bildaufnahmezeiten und der damit verbundenen umfangreichen und komplexen Datenverarbeitung eine anspruchsvolle Aufgabe darstellt (2).
Optimierung von Lebensfähigkeitstests
Es gibt mehrere Möglichkeiten, einen herkömmlichen Lebensfähigkeitstest für den Einsatz in 3D-Kulturen zu optimieren (1).
1) Verbesserte Inkubationszeit mit Testreagenzien abhängig von der Größe des Sphäroids. Für eine ausreichende Durchdringung der Testreagenzien sollte ausreichend Zeit eingeplant werden.
2) Berücksichtigung der Kompaktheit des Sphäroids. Größere und kompaktere MCTs erfordern längere Inkubationszeiten mit Testreagenzien, um eine ausreichende Penetration sicherzustellen.
3) Die Fluoreszenzauslesung sollte unter Berücksichtigung der Größe und strukturellen Eigenschaften der MCTs analysiert werden.
ATP- und Apoptose-Assays
Der Zelltod in MCTs wird typischerweise mittels Durchflusszytometrie durch Annexin V/PI-Färbung analysiert. MCTs werden durch enzymatische Dissoziation zu einer Einzelzellsuspension aufgeschlossen (3-5). Es ist wichtig, dass die Zellen eine vollständige Dissoziation durchlaufen, ohne ihre Lebensfähigkeit zu verändern, um eine genaue Aussage über die Apoptose zu erhalten.
Die Zelllebensfähigkeit von MCTs wird auch durch Messung des ATP-Gehalts in den Zellen analysiert. Die variablen physikalischen Eigenschaften von MCTs wie Größe, Zusammensetzung und Eindringtiefe können die Genauigkeit der Messwerte beeinträchtigen, obwohl sich jüngste Versuche zur Optimierung der Waschmittelzusammensetzung und der Lysebedingungen als wirksam bei der Bewältigung dieser Herausforderungen erwiesen haben (6-8). Zusätzlich wird der ATP-Gehalt mittels Biolumineszenz nachgewiesen, was übrigens robuste, sensible Daten liefert, die für Hochdurchsatz-Screening skalierbar sind. Andere Marker der Zelllebensfähigkeit, zu denen der Sauerstoff-/Nährstoffverbrauch und die Aktivität metabolischer Enzyme gehören, werden ebenfalls routinemäßig zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit in MCTs eingesetzt (6,9–10).
Bibliographie
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